ELISA試劑盒的實(shí)驗原理在我們平時看來覺得很簡單，無非就是固定抗原，添加一抗、二抗和底物，間中夾雜著洗滌和閉。然而，即使是平常的洗滌和封閉，如果做得不太好，也有可能影響整個實(shí)驗。在做完實(shí)驗時，我們是否能獲得有用的信息，這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會直接關(guān)系到結(jié)果的判斷。那么怎樣才能降低ELISA試劑盒實(shí)驗中的背景因素呢，下面我們來仔細(xì)說說。
 

　　1.洗滌
 

　　洗滌步驟看似很無聊，其實(shí)很重要，因為如果未結(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中，那么它會增加背景噪音。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過高，而您懷疑洗滌不夠時，可以嘗試增加洗滌次數(shù)。
 

　　2.封閉
 

　　封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過高，懷疑封閉不充分，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當(dāng)延長封閉時間。如果您一直被背景問題所困擾，那么也許您該花些時間來優(yōu)化封閉液。這可能需要時間，但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個因素，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定，在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時起作用，因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會降低特異結(jié)合，產(chǎn)生假陰性。另一個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉。蛋白封閉液則有所不同。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉，同時穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。
 

　　3.抗體濃度
 

　　如果試劑稍有不同，則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住，非特異的抗體結(jié)合會增加背景。為了防止這一點(diǎn)，切勿使用過多的一抗或二抗。
 

　　4.檢測試劑
 

　　另一點(diǎn)也很顯而易見：切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高，或者未正確稀釋，則會導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度，如有必要，優(yōu)化一下何時應(yīng)加入終止液。